扫描免疫电镜技术

扫描免疫电镜技术可为研究细胞或组织表面的三维结构与抗原组成的关系提供可能性。
（一）原理 免疫电镜技术是免疫组织化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。它主要分为两大类：一类是免疫凝集电镜技术，即采用抗原抗体凝集反应后，再经负染色直接在电镜下观察；另一类则是免疫电镜定位 技术。该项技术是利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合，在电子显微镜下观察，由于标准物形成一定的电子密度而指示出相应抗原所在的部位。免疫电镜的应 用，使得抗原和抗体定位的研究进入到亚细胞的水平。
（二）标记物
应用于扫描电镜的标记物应能在扫描电镜可分辨的范围内，并能对细胞或组织 抗原有较好的定位能力。在选择标记物时应根据研究目的而定，如标记细胞等由于体积较大，可用体积大的标记物；如鉴别阳性（标记细胞）与阴性（未标记细 胞），而要定位受体等则需选用较小的，易于辨认的标记物。 医学百科网 | YxBaike.Com
常用的标记物为颗粒性标记物。依其特性可分为：
1．蛋白类 如血蓝蛋白、铁蛋白等。
2．病原体类 如烟草花叶病毒、南方菜豆花叶病毒、噬菌体T4、大肠杆菌f2、噬菌体等。
3． 金属颗粒胶体金、免疫金银标记技术和同位素放射性自显影的银颗粒等。其中以金属类颗粒标记物应用最为广泛。最常用的是胶体金，胶体金商品提供的直径从 3～150nm不等，扫描免疫电镜常用的金颗粒直径在30～60nm左右为宜。由于金本身系重金属，有较强的发射2次电子的作用，故不需喷镀金属膜，这是 胶体金应用于免疫扫描电镜的标记优于其它标记物之处。免疫金银染色能加强细胞或组织表面金属颗粒聚集的密度。金、银粒在电镜显示为电子密度高，外形清晰的 颗粒易于识别和定位。病原体标记物主要利用其特异殊的外形和结构以达到标记定位的目的，如噬菌体T4形似星形的球拍，头部大约100nm直径，呈六角形星 状，尾长约100nm，由颈部与头部相接；烟草花叶病毒为15×30nm的杆状病毒，而南方菜豆花叶病毒是直径25nm的园形颗粒，这些病原体的典型外形 很易于辨认。铁蛋白由于含有致密的铁离子核心具有较高的电子密度，从而达到标记定位的目的。血蛋白是由海螺类软体动物中提取的多分子聚合物，其外形为 35×50nm的柱状体，多应用于病毒研究，但也有利用血蓝蛋白与过氧化物等的糖蛋白部份可与凝集素相结合的特性，进行细胞膜受体的定位。
（三）免疫标记方法
金 属类标记物的免疫标记法同切片免疫染色，即将标记物与抗体相结合，通过直接或间接法显示抗原部位。胶体金可与蛋白A相结合后与IgG分子中的Fc 段相结合。再与卵白素（a－vidin）相结合可与结合抗体的生物素（biotin）反应。免疫金银染色法在胶体金标记后，再进行银液显影。病毒（包括噬菌体）标记物多采用不标记抗体法，即搭桥法。此法的原理是采用同种动物制备抗原的特异性抗体与标记物抗体（例如兔抗A抗原与兔抗HRP）。再用另一种动物制备第一种动物血清抗体的抗体（例如羊抗兔IgG抗体）。利用后者为桥，把抗原的特异性抗体与抗标记物抗体结合起来，后者再与标记物结合，以达到定位抗原 的目的，其基本原理与PAP法类同。病原体免疫标记可不用标记物显示，而利用其形态学特征定位或采用抗原抗体凝集法，其基本原理是利用病毒或病毒抗原的特异性抗体在与相应的抗原反应后，使后者之间发生交联而凝集，经浓缩后用阴性染色法（负染）便可在电镜下显示定位。 医学百科网 | YxBaike.Com